Javascript è attualmente disabilitato nel tuo browser.Diverse funzionalità di questo sito non funzioneranno mentre javascript è disabilitato.accesso aperto alla ricerca scientifica e medicaDalla presentazione alla prima decisione editoriale.Dall'accettazione editoriale alla pubblicazione.La suddetta percentuale di manoscritti è stata respinta negli ultimi 12 mesi.Riviste scientifiche e mediche peer-reviewed ad accesso libero.Dove Medical Press è membro dell'OAI.Ristampe in blocco per l'industria farmaceutica.Offriamo vantaggi reali ai nostri autori, inclusa l'elaborazione accelerata degli articoli.Registra i tuoi dettagli specifici e farmaci specifici di interesse e abbineremo le informazioni fornite agli articoli dal nostro ampio database e ti invieremo prontamente copie PDF via e-mail.Torna a Diari » Diabete, sindrome metabolica e obesità: obiettivi e terapia » Volume 14L'astragaloside IV inibisce l'apoptosi mitocondriale-dipendente del ganglio della radice dorsale nella neuropatia periferica diabetica Ratti attraverso la modulazione della via di segnalazione SIRT1/p53Autori Ben Y, Hao J, Zhang Z, Xiong Y, Zhang C, Chang Y, Yang F, Li H, Zhang T, Wang X, Xu QPubblicato il 14 aprile 2021 Volume 2021:14 Pagine 1647—1661DOI https://doi.org/10.2147/DMSO.S301068Revisione tramite revisione tra pari anonima singolaEditore che ha approvato la pubblicazione: Prof. Dr. Juei-Tang ChengYing Ben,1,2,* Juan Hao,1,* Zhihong Zhang,1,2 Yunzhao Xiong,1 Cuijuan Zhang,1,2 Yi Chang,1,2 Fan Yang,1,2 Hui Li,1,2 Tianya Zhang ,1 Xiangting Wang,1,2 Qingyou Xu1,2 1Hebei University of Chinese Medicine, Shijiazhuang, Hebei, Repubblica popolare cinese;2Hebei Key Laboratory of Integrative Medicine on Liver-Kidney Patterns, Hebei University of Chinese Medicine, Shijiazhuang, Hebei, People's Republic of China *Questi autori hanno contribuito in egual modo a questo lavoro Corrispondenza: Qingyou Xu Hebei University of Chinese Medicine, No. 326 Xinshinan Road, Distretto di Qiaoxi, Shijiazhuang, provincia di Hebei, 050090, Repubblica popolare cinese Tel +86 13832368865 Fax +86 311 89926000 Email [email protetta] Scopo: studiare l'effetto dell'astragaloside IV (AS-IV) sull'apoptosi mitocondriale-dipendente nella dorsale ganglio della radice di ratti con neuropatia periferica diabetica (DPN) attraverso il percorso SIRT1/p53.Metodi: il modello di ratto diabetico è stato indotto da una dieta ricca di carboidrati/grassi e iniezione intraperitoneale di STZ.I ratti diabetici sono stati divisi in tre gruppi (n = 16 per gruppo): gruppo DPN, gruppo AS-IV (60 mg/kg/giorno) e gruppo acido α-lipoico (ALA) (60 mg/kg/giorno).Il peso e i livelli di glucosio nel sangue sono stati monitorati ogni 4 settimane per 12 settimane.La DPN è stata valutata utilizzando il test dei filamenti di Von Frey e la velocità di conduzione nervosa.I gangli della radice dorsale dei ratti sono stati isolati e le alterazioni patologiche dei mitocondri sono state osservate mediante microscopia elettronica.Sono state misurate l'attività del complesso della catena di trasporto degli elettroni mitocondriali, il potenziale di membrana mitocondriale, i livelli di malonaldeide (MDA) e glutatione (GSH).L'apoptosi neurale è stata rilevata utilizzando il kit di test Terminal Deoxynucleotidyl Nick-End Labeling (TUNEL).La caspasi-3 scissa, le principali proteine ​​​​nel percorso SIRT1/p53, inclusi SIRT1, acetil p53, Drp1, BAX e BCL-2, sono state rilevate mediante immunoistochimica e Western blot.È stata rilevata anche l'espressione genica delle principali proteine ​​​​nel percorso SIRT1/p53.RISULTATI: Dopo 12 settimane di trattamento, AS-IV e ALA non hanno influenzato significativamente il peso corporeo oi livelli di glucosio a digiuno, ma hanno ridotto il dolore meccanico anomalo nella DPN e hanno migliorato la velocità di conduzione nervosa.AS-IV e ALA hanno aumentato il livello di GSH e diminuito il livello di MDA.Sia AS-IV che ALA possono ridurre il danno mitocondriale, migliorare l'attività del complesso della catena di trasporto degli elettroni mitocondriali e il potenziale della membrana mitocondriale e ridurre le percentuali di cellule positive con frammentazione del DNA e l'espressione della proteina caspasi-3 scissa.AS-IV e ALA hanno sovraregolato l'espressione di SIRT1 e giù regolato l'espressione di acetil-p53, Drp1 e il rapporto tra BAX e BCL-2.I cambiamenti nell'espressione genica erano simili.Conclusione: AS-IV può ridurre il verificarsi di apoptosi mitocondriale-dipendente regolando il percorso SIRT1/p53.Ha un effetto terapeutico simile all'ALA ed è quindi un farmaco promettente per il potenziale trattamento della DPN.Parole chiave: astragaloside IV, neuropatia periferica diabetica, ganglio della radice dorsale, mitocondri, apoptosi, via SIRT1/p53La neuropatia periferica diabetica (DPN) è una delle complicanze croniche più comuni nei pazienti diabetici e la sua prevalenza può raggiungere il 50%.1 Questa condizione è caratterizzata da dolore, parestesia e perdita sensoriale.Nei casi più gravi possono comparire ulcere refrattarie, che possono eventualmente portare all'amputazione dell'arto colpito.Sfortunatamente, il successo del trattamento e della prevenzione rimane difficile a causa della mancanza di conoscenza sui meccanismi di sviluppo della DPN.2 Studi hanno dimostrato che il controllo glicemico rigoroso migliora ma non inverte la neuropatia nei pazienti di tipo 1.3,4 Al contrario, il controllo glicemico è relativamente inefficace nella prevenzione della neuropatia diabetica nel diabete di tipo 2.5Il danno mitocondriale nei neuroni, negli assoni e nelle cellule di Schwann del ganglio della radice dorsale (DRG) è stato proposto come meccanismo unificante per la neuropatia diabetica.6-10 Studi hanno dimostrato che p53 promuove l'apoptosi regolando la fissione mitocondriale.11 p53 può essere trasportato dal nucleo a il citoplasma, dove aiuta a traslocare Drp1 sulla superficie mitocondriale,12 causando la scissione dei mitocondri in diversi frammenti e influenzandone la funzione.13 Allo stesso tempo, p53 può sovraregolare l'espressione di BAX, sottoregolare l'espressione di BCL-2, aumentare la permeabilità del membrana esterna mitocondriale e inducono il rilascio del citocromo C dallo spazio intermembrana mitocondriale per avviare l'apoptosi.Sirtuin 1 (SIRT1) è una proteina deacetilasi che dipende dalla nicotinamide adenina dinucleotide (NAD+).SIRT1 catalizza la deacetilazione di p53 a K382.14,15 Sulla base di studi recenti, l'opinione generale è che la funzione di p53 sia inibita dalla deacetilazione di K382 al C-terminale.16,17 L'inibizione della funzione di p53 può essere un meccanismo principale per la funzione anti-invecchiamento e di promozione della sopravvivenza cellulare di SIRT1.8,18-20L'astragaloside IV (AS-IV) è una saponina biologicamente attiva isolata dalla radice di astragalo.Alcuni studi sulle malattie neurodegenerative (come il morbo di Parkinson e il morbo di Alzheimer) hanno dimostrato che l'AS-IV ha un effetto protettivo sul danno mitocondriale e può inibire l'apoptosi neuronale.21-23 Inoltre, l'AS-IV ha anche un forte stress antiossidante effetto.24,25 L'acido α-lipoico (ALA) è un noto antiossidante ed è stato ampiamente utilizzato per trattare la DPN.26,27 Gli studi hanno scoperto che può sovraregolare l'espressione di SIRT1.28,29 Sulla base dei benefici di cui sopra effetti, ipotizziamo che AS-IV possa proteggere i mitocondri e inibire l'apoptosi dei neuroni gangliari della radice dorsale attraverso il percorso SIRT1/p53.Pertanto, in questo esperimento, abbiamo utilizzato l'ALA come controllo positivo per studiare gli effetti benefici dell'AS-IV sui gangli della radice dorsale dei ratti diabetici indotti dall'adiuvante della streptozotocina e da una dieta ricca di carboidrati/grassi.La nostra ricerca mirava a fornire alcuni indizi per dimostrare che l'AS-IV può essere un farmaco candidato efficace e fattibile per il trattamento della neuropatia periferica diabetica.Sessantaquattro ratti Sprague Dawley maschi (3 settimane di età, 110 ± 10 g) sono stati acquistati da Vital Rive Experimental Animal Technology Co., Ltd. (Pechino, Cina) SCXK [Pechino] 2016-0006.Gli animali sono stati posti in un ambiente con ciclo luce-buio artificiale di 12 ore/12 ore con una temperatura di 22–24 °C e un'umidità del 40%.Gli animali sono stati tenuti in 16 gabbie con 4 ratti in ciascuna gabbia e la lettiera veniva cambiata ogni giorno.Tutti i seguenti esperimenti sono conformi ai "Principi guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio" promulgati dalla National Science and Technology Commission of China.Sedici ratti sono stati selezionati casualmente come gruppo di controllo e hanno ricevuto una dieta standard.I restanti 48 ratti sono stati alimentati con una dieta ricca di carboidrati/ad alto contenuto di grassi (67% di dieta standard, 10% di strutto, 20% di saccarosio, 2,5% di colesterolo e 0,5% di colato di sodio) per 6 settimane e sono stati quindi iniettati per via intraperitoneale con streptozotocina ( STZ) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) (25 mg/kg) due volte con un intervallo di 2 giorni.Una settimana dopo l'iniezione di STZ, animali con livelli di glucosio nel sangue a digiuno ≥16,7 mmol/L sono stati utilizzati come animali diabetici e hanno continuato a essere alimentati con una dieta ricca di carboidrati/ricca di grassi.Quarantotto ratti diabetici sono stati divisi casualmente nel gruppo DPN, DPN più gruppo ALA e DPN più gruppo AS-IV, con 16 ratti in ciascun gruppo.Al gruppo DPN più ALA sono stati somministrati 60 mg/kg di ALA (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) mediante somministrazione intragastrica ogni giorno, mentre al gruppo DPN più AS-IV sono stati somministrati 60 mg/kg di AS-IV (Chengdu Herbpurify Co., Ltd. Chengdu, Cina) ogni giorno;il gruppo di controllo e il gruppo DPN hanno ricevuto la stessa quantità di soluzione fisiologica normale per somministrazione intragastrica ogni giorno.Il trattamento farmacologico è durato 12 settimane.Il successo dell'induzione del diabete è stato registrato come settimana 0. La glicemia a digiuno e il peso corporeo dei ratti in ciascun gruppo sono stati misurati rispettivamente alla 4a, 8a e 12a settimana.Come descritto in Ueda e Neyama,30 lo strumento per anestesia elettronico von Frey è stato utilizzato per rilevare la soglia del dolore dei ratti sperimentali (tipo 2390, sonda da 90 g, diametro 0,8 mm; IITC Life Science Inc., Woodland Hills, CA, USA) .La punta rigida è stata utilizzata per stimolare meccanicamente la parte centrale della superficie plantare della zampa posteriore del ratto e la pressione richiesta per indurre la risposta di ritiro è stata definita come soglia del dolore, che è stata registrata in grammi.Il test è stato ripetuto una volta ogni 5 minuti, con cinque misurazioni per ogni animale, ed è stato calcolato il valore medio.Dopo che i ratti sperimentali sono stati anestetizzati con isoflurano al 3% in volume, è stato aggiunto 1e1,2% di isoflurano all'ossigeno attraverso una maschera per mantenere l'anestesia e i ratti sono stati fissati in posizione prona.Gli elettrodi di stimolazione e registrazione del filo di platino sono stati posizionati direttamente sotto il tronco del nervo sciatico della gamba destra.Un pezzo di pelle tra il bicipite femorale e i muscoli semitendinosi è stato inciso e staccato per esporre il nervo sciatico in due siti per attaccare gli elettrodi.L'elettrodo di stimolazione è stato posizionato nella tacca del nervo sciatico.Il nervo sciatico è stato stimolato con singole onde quadre plus (1,2 V di intensità, 1 ms di larghezza) attraverso il Functional Experiment System (BL-420s, Taimeng, Sichuan, Cina).Sono state misurate la latenza del potenziale d'azione (L) del nervo sciatico e la distanza (D) tra i due elettrodi per calcolare il motore NCV (MNCV), MNCV = D/L(m/s).La NCV sensoriale (SNCV) è stata misurata e registrata scambiando l'elettrodo di stimolazione e quello di registrazione.I parametri di stimolazione e la procedura di calcolo SNCV erano gli stessi dei metodi MNCV.Microscopia elettronica: i gangli della radice dorsale L4-5 sono stati fissati in glutaraldeide al 4% e trattati con OsO4 all'1% in PBS 0,1 M.I campioni sono stati disidratati mediante successiva applicazione di soluzioni di acetone graduato e incorporati in EPON 812. Sezioni ultrasottili (70 nm) sono state poste su una griglia di rame e colorate con acetato di uranile e citrato di piombo.I campioni sono stati osservati mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM, JEM-1230, Tokyo, Giappone).Sono state valutate le alterazioni patologiche dei mitocondri nei neuroni.Il livello dei mitocondri intatti è stato determinato utilizzando l'indice di qualità mitocondriale (MQI) pubblicato.31 In breve, ai mitocondri individuali è stato assegnato uno dei seguenti gradi: 1 – completamente intatto, 2 – rottura delle creste (tipicamente da rigonfiamento o perdita di integrità del la membrana interna), 3 – rottura della membrana mitocondriale esterna e 4 – rottura delle creste e della membrana esterna.Immunoistochimica: i gangli della radice dorsale L4-5 sono stati rapidamente raccolti e fissati in paraformaldeide al 4% durante la notte.Il tessuto è stato quindi paraffinato e tagliato in sezioni da 4 μm.Le sezioni sono state deparaffinate, l'antigene è stato riparato con una soluzione di acido citrico (0,01 mol/L, pH 6,0) e le sezioni sono state quindi incubate con H2O2 al 3% per ridurre la colorazione di fondo non specifica causata dalla perossidasi endogena.Le sezioni sono state bloccate con siero non immunoreattivo e quindi incubate con anticorpi contro SIRT1, acetil-p53, Drp1, BAX, BCL-2 e cleaved-caspase-3 a 4 ° C durante la notte.Il giorno successivo, le sezioni sono state incubate con anti-coniglio di capra (Beijing nobile Ryder Technology Co., Ltd., Pechino, Cina), colorate con cromogeno diamminobenzidina (DAB) e quindi controcolorate con ematossilina.Abbiamo osservato e analizzato le sezioni utilizzando un microscopio ottico (Olympus, Bx53F, Tokyo, Giappone).Gli anticorpi primari sono stati utilizzati nelle seguenti diluizioni: SIRT1, 1:200 (Abcam, Cambridge, UK);acetile-p53, 1:200 (Abcam, Cambridge, Regno Unito);Drp1, 1:400 (Abcam, Cambridge, Regno Unito);BAX, 1:400 (Protaintech, Rosemont, IL, USA);BCL-2, 1:200 (Affinity Bioscience, Cincinnati, OH, USA);e caspase-3, 1:200 (Cell Signaling, Danvers, MA, USA).I mitocondri sono stati estratti dal ganglio della radice dorsale secondo il metodo dell'Animal Tissue Active Mitochondria Isolation Kit (Genmed Scientifics Inc., Ellington, TX, USA).L'attività del complesso I, II, III e IV nella catena di trasporto degli elettroni mitocondriali è stata rilevata mediante colorimetria chimica (Genmed Scientifics Inc., Ellington, TX, USA).L'attività del complesso I è stata misurata dall'ossidazione di NADH da parte dell'ubichinone-1 a 340 nm, l'attività del complesso II è stata misurata dall'ossidazione del succinato da parte dell'ubichinone-2 a 600 nm, l'attività del complesso III è stata valutata dalla riduzione del citocromo C da parte dell'ubichinolo- 2 a 550 nm e l'attività del complesso IV è stata saggiata mediante l'ossidazione del citocromo C ridotto con ditionite a 550 nm.I saggi per i complessi I e III sono stati eseguiti in presenza e in assenza degli inibitori specifici rotenone e antimicina A, rispettivamente, per valutare il contributo delle attività contaminanti.La concentrazione finale delle proteine ​​totali è stata determinata con il metodo di Lowry et al.32 L'attività del complesso è stata espressa come la velocità con cui ciascun complesso nella proteina unitaria ha ridotto il substrato nella reazione catalitica (U/mg/min).La misurazione del potenziale della membrana mitocondriale è stata eseguita secondo il protocollo del kit di rilevamento del potenziale della membrana mitocondriale (Genmed Scientifics Inc., Ellington, TX, USA).I campioni mitocondriali sono stati incubati con soluzione di lavoro colorante ioduro di 5,5',6,6'-tetracloro-1,1',3'-tetraetilbenzimidazolcarbocianina a temperatura ambiente per 10 minuti.Le unità di fluorescenza relativa (RFU) sono state ottenute misurando le lunghezze d'onda di eccitazione/emissione a 490/590 nm con un lettore di micropiastre a fluorescenza (BioTek, Synergy H4, Winooski, VT, USA).Il potenziale di membrana mitocondriale è stato espresso come RFU per mg di proteina (RFU/mg).Come marker di stress ossidativo, i livelli di glutatione (GSH) e malondialdeide (MDA) del ganglio della radice dorsale sono stati misurati da un lettore di micropiastre (BioTek, Synergy H4, Winooski, VT, USA) utilizzando i kit di analisi (Nanjing Jiancheng Bioengineering Research Institute , Nanchino, Cina) secondo la procedura consigliata dal produttore.L'apoptosi neuronale è stata determinata utilizzando un kit di test di etichettatura terminale del deossinucleotidil nick-end (TUNEL) secondo il protocollo del produttore (Roche, Basilea, Svizzera).La percentuale di cellule TUNEL-positive è stata calcolata dividendo il numero di nuclei colorati positivi per il numero totale di nuclei in un dato campo visivo (con un ingrandimento di 400 × al microscopio).La proteina dei gangli della radice dorsale L4-5 isolata è stata estratta e separata mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide di sodio dodecil solfato all'8-12% (SDS-PAGE) e ulteriormente trasferita su membrane di fluoruro di polivinilidene (PVDF).Dopo aver bloccato con latte scremato al 5% per 2 ore, le membrane PVDF sono state incubate con anticorpi primari specifici a 4°Cover-notte e lavate.Le membrane sono state incubate con anticorpi secondari per 1 ora.Il rilevamento è stato visualizzato utilizzando il sistema di imaging a infrarossi Odyssey (LI-COR, Inc., Lincoln, NA, USA) e analizzato con il software Image J.I livelli basali delle proteine ​​sono stati normalizzati ai livelli della proteina β-actina.Gli anticorpi primari sono stati utilizzati nelle seguenti diluizioni: SIRT1, 1:400 (Abcam, Cambridge, UK);acetile-p53, 1:500 (Abcam, Cambridge, Regno Unito);Drp1, 1:1000 (Abcam, Cambridge, Regno Unito);BAX, 1:2000 (Protaintech, Rosemont, IL, USA);BCL-2, 1:500 (Affinity Bioscience, Cincinnati, OH, USA);e caspasi-3 scissa, 1:1000 (Cell Signaling, Danvers, MA, USA);β-actina,1:5000 (Abways, Shanghai, Cina).L'RNA totale è stato estratto dal ganglio della radice dorsale utilizzando TRIzol (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) secondo il protocollo del produttore.Il cDNA è stato sintetizzato dall'mRNA utilizzando un kit di sintesi del cDNA del primo filamento RevertAid (Thermo Fisher Scientific, Inc. Waltham, MA, USA), seguito da qPCR utilizzando un Master Mix SYBR® Green PCR (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc. Waltham, MA, USA) e il sistema di rilevamento della sequenza StepOnePlus (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc. Waltham, MA, USA).Le condizioni di ciclo delle reazioni erano le seguenti: 10 minuti di predenaturazione a 95°C seguiti da 40 cicli di 15 s di denaturazione a 95°C e 60 s di ricottura a 60°C.Le sequenze dei primer utilizzati sono elencate nella Tabella 1. Per la normalizzazione è stato utilizzato il gene housekeeping β-actina.Tabella 1 Informazioni sui primer per RT-PCRTabella 1 Informazioni sui primer per RT-PCRIl software di analisi statistica SPSS 24.0 è stato utilizzato per analizzare i dati e i dati di misurazione sono stati descritti dalla media ± deviazione standard (SD).In primo luogo, è stata eseguita l'analisi della varianza per il confronto di più gruppi, quindi è stato utilizzato il test di Tukey per confronti multipli.I test statistici sono stati eseguiti utilizzando test bilaterali e si è ritenuto che P ≤ 0,05 indicasse differenze statisticamente significative.Come mostrato nella Figura 1A, i ratti iniettati con STZ hanno mostrato iperglicemia.I ratti diabetici avevano livelli di glucosio nel sangue a digiuno significativamente più alti rispetto ai ratti nel gruppo di controllo (p <0,001).Il trattamento con ALA o AS-IV non ha comportato cambiamenti significativi nei livelli di glucosio nel sangue a digiuno dei ratti DPN.Come mostrato nella Figura 1B, i pesi dei ratti diabetici alla 4a, 8a e 12a settimana non erano significativamente diversi da quello del gruppo di controllo.Figura 1 Effetti di AS-IV sulla glicemia a digiuno e sul peso corporeo nei ratti diabetici a 12 settimane.Abbreviazioni: SD, deviazione standard;DPN, neuropatia periferica diabetica;AS-IV, astragaloside IV;ALA, acido α-lipoico.Note: i livelli di glucosio nel sangue a digiuno (A) e il peso corporeo (B) sono stati misurati ogni 4 settimane.I dati sono rappresentati come media ± DS.***P < 0,001 rispetto al gruppo di controllo.Figura 1 Effetti di AS-IV sulla glicemia a digiuno e sul peso corporeo nei ratti diabetici a 12 settimane.Abbreviazioni: SD, deviazione standard;DPN, neuropatia periferica diabetica;AS-IV, astragaloside IV;ALA, acido α-lipoico.Note: i livelli di glucosio nel sangue a digiuno (A) e il peso corporeo (B) sono stati misurati ogni 4 settimane.I dati sono rappresentati come media ± DS.***P < 0,001 rispetto al gruppo di controllo.I ratti iniettati con STZ mostravano iperalgesia meccanica.I ratti diabetici erano meno tolleranti alla pressione applicata alla zampa rispetto ai ratti nel gruppo di controllo.Il trattamento ALA o AS-IV è stato in grado di ridurre significativamente l'iperalgesia meccanica delle zampe posteriori dei ratti DPN (p <0,01), come mostrato nella Figura 2.Figura 2 Effetti di AS-IV sulle soglie di ritiro della zampa.Abbreviazioni: SD, deviazione standard;DPN, neuropatia periferica diabetica;AS-IV, astragaloside IV;ALA, acido α-lipoico.Note: i dati sono rappresentati come media ± DS.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 rispetto al gruppo di controllo.##P < 0,01 rispetto al gruppo DPN.Figura 2 Effetti di AS-IV sulle soglie di ritiro della zampa.Abbreviazioni: SD, deviazione standard;DPN, neuropatia periferica diabetica;AS-IV, astragaloside IV;ALA, acido α-lipoico.Note: i dati sono rappresentati come media ± DS.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 rispetto al gruppo di controllo.##P < 0,01 rispetto al gruppo DPN.I ratti del gruppo DPN presentavano diminuzioni significative di MNCV e SNCV rispetto ai ratti del gruppo di controllo.Il MNCV e SNCV dei due gruppi di ratti trattati con ALA e AS-IV erano superiori a quelli del gruppo DPN (Figura 3A e B).Figura 3 Effetto di AS-IV su NCV.Abbreviazioni: NCV, velocità di conduzione nervosa;MNCV, velocità di conduzione del nervo motorio;SNCV, velocità di conduzione del nervo sensoriale;SD, deviazione standard;DPN, neuropatia periferica diabetica;AS-IV, astragaloside IV;ALA, acido α-lipoico.Note: (A) MNCV;(B) SNCV.I dati sono rappresentati come media ± DS.*P < 0,05, **P < 0,01;***P < 0,001 rispetto al gruppo di controllo.#P < 0,05, ##P < 0,01 rispetto al gruppo DPN.Figura 3 Effetto di AS-IV su NCV.Abbreviazioni: NCV, velocità di conduzione nervosa;MNCV, velocità di conduzione del nervo motorio;SNCV, velocità di conduzione del nervo sensoriale;SD, deviazione standard;DPN, neuropatia periferica diabetica;AS-IV, astragaloside IV;ALA, acido α-lipoico.Note: (A) MNCV;(B) SNCV.I dati sono rappresentati come media ± DS.*P < 0,05, **P < 0,01;***P < 0,001 rispetto al gruppo di controllo.#P < 0,05, ##P < 0,01 rispetto al gruppo DPN.La diminuzione di NCV e l'iperalgesia meccanica hanno convalidato il modello DPN.33Nel gruppo di controllo, i neuroni gangliari della radice dorsale erano ricchi di mitocondri e avevano strutture normali.Le membrane mitocondriali interne ed esterne e le creste mitocondriali erano intatte e ben distribuite.Nel gruppo DPN, i mitocondri dei neuroni gangliari della radice dorsale erano gonfi e degenerati, la membrana mitocondriale esterna era danneggiata e le creste mitocondriali erano rotte, sparse o addirittura scomparse e la maggior parte mostrava alterazioni vacuolari.I mitocondri sono i più distruttivi, con il punteggio MQI più alto (4 punti).I mitocondri dei neuroni DRG nei gruppi DPN più ALA e DPN più AS-IV erano leggermente gonfi, con una struttura relativamente completa e creste mitocondriali chiare.Il punteggio MQI della maggior parte dei mitocondri era 2–3.Il danno mitocondriale nei ratti trattati con ALA e AS-IV è stato alleviato rispetto al gruppo DPN (Figura 4A e B).Figura 4 Effetto di AS-IV sulla patomorfologia mitocondriale.Abbreviazioni: SD, deviazione standard;DPN, neuropatia periferica diabetica;AS-IV, astragaloside IV;ALA, acido α-lipoico.Note: (A) Le micrografie elettroniche hanno illustrato i mitocondri intatti (frecce bianche).Barra della scala, 1 µm.(B) Punteggio dell'indice di qualità dei mitocondri.I dati sono rappresentati come media ± DS.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 rispetto al gruppo di controllo.##P < 0,01, ###P < 0,001 rispetto al gruppo di controllo.Figura 4 Effetto di AS-IV sulla patomorfologia mitocondriale.Abbreviazioni: SD, deviazione standard;DPN, neuropatia periferica diabetica;AS-IV, astragaloside IV;ALA, acido α-lipoico.Note: (A) Le micrografie elettroniche hanno illustrato i mitocondri intatti (frecce bianche).Barra della scala, 1 µm.(B) Punteggio dell'indice di qualità dei mitocondri.I dati sono rappresentati come media ± DS.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 rispetto al gruppo di controllo.##P < 0,01, ###P < 0,001 rispetto al gruppo di controllo.L'attività misurata del complesso I, II, III e IV nella catena di trasporto degli elettroni mitocondriali è mostrata nella Figura 5A-D.Le attività del complesso I, II, III e IV erano significativamente inferiori nella DPN rispetto al gruppo di controllo (p <0,01).I livelli dei due gruppi di ratti trattati con ALA e AS-IV sono stati ripristinati ed erano superiori a quelli degli animali DPN (p <0,05).Le attività del complesso I, II, III dei due gruppi di ratti trattati con ALA e AS-IV non erano statisticamente differenti da quella del gruppo di controllo e l'attività del composto IV era inferiore a quella del gruppo di controllo (p < 0,05).Figura 5 Effetto di AS-IV sull'attività del complesso della catena di trasporto degli elettroni mitocondriali.Abbreviazioni: SD, deviazione standard;DPN, neuropatia periferica diabetica;AS-IV, astragaloside IV;ALA, acido α-lipoico.Note: (A) Attività del complesso I della catena di trasporto degli elettroni mitocondriali.(B) Attività del complesso II della catena di trasporto degli elettroni mitocondriali.(C) Attività del complesso III della catena di trasporto degli elettroni mitocondriali.(D) Attività IV del complesso della catena di trasporto degli elettroni mitocondriali.I dati sono rappresentati come media ± DS.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 rispetto al gruppo di controllo.#P < 0,05 rispetto al gruppo DPN.Figura 5 Effetto di AS-IV sull'attività del complesso della catena di trasporto degli elettroni mitocondriali.Abbreviazioni: SD, deviazione standard;DPN, neuropatia periferica diabetica;AS-IV, astragaloside IV;ALA, acido α-lipoico.Note: (A) Attività del complesso I della catena di trasporto degli elettroni mitocondriali.(B) Attività del complesso II della catena di trasporto degli elettroni mitocondriali.(C) Attività del complesso III della catena di trasporto degli elettroni mitocondriali.(D) Attività IV del complesso della catena di trasporto degli elettroni mitocondriali.I dati sono rappresentati come media ± DS.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 rispetto al gruppo di controllo.#P < 0,05 rispetto al gruppo DPN.Come mostrato nella Figura 6, il potenziale della membrana mitocondriale del ganglio della radice dorsale dei ratti DPN è stato significativamente ridotto rispetto ai ratti di controllo (p <0,001) e anche quello del gruppo di trattamento ALA o AS-IV è diminuito (p <0,01).Il potenziale della membrana mitocondriale era maggiore nei due gruppi di animali trattati con ALA e AS-IV rispetto agli animali DPN (p <0,05).Figura 6 Effetto di AS-IV sul potenziale di membrana mitocondriale.Abbreviazioni: SD, deviazione standard;DPN, neuropatia periferica diabetica;AS-IV, astragaloside IV;ALA, acido α-lipoico.Note: i dati sono rappresentati come media ± DS.**P < 0,01, ***P < 0,001 rispetto al gruppo di controllo.#P < 0,05 rispetto al gruppo DPN.Figura 6 Effetto di AS-IV sul potenziale di membrana mitocondriale.Abbreviazioni: SD, deviazione standard;DPN, neuropatia periferica diabetica;AS-IV, astragaloside IV;ALA, acido α-lipoico.Note: i dati sono rappresentati come media ± DS.**P < 0,01, ***P < 0,001 rispetto al gruppo di controllo.#P < 0,05 rispetto al gruppo DPN.Come mostrato nella Figura 7A, il contenuto di MDA nei gangli della radice dorsale dei ratti diabetici era superiore a quello del gruppo di controllo.Il contenuto di MDA dei due gruppi di ratti trattati con ALA e AS-IV era inferiore a quello del gruppo DPN (p <0,01).Figura 7 Effetto di AS-IV sullo stress ossidativo.Abbreviazioni: MDA, malonaldeide;GSH, glutatione;SD, deviazione standard;DPN, neuropatia periferica diabetica;AS-IV, astragaloside IV;ALA, acido α-lipoico.Note: (A) MDA, (B) GSH.I dati sono rappresentati come media ± SD.*P < 0,05, **P < 0,01;***P < 0,001 rispetto al gruppo di controllo.#P < 0,05, ##P < 0,01 rispetto al gruppo DPN.Figura 7 Effetto di AS-IV sullo stress ossidativo.Abbreviazioni: MDA, malonaldeide;GSH, glutatione;SD, deviazione standard;DPN, neuropatia periferica diabetica;AS-IV, astragaloside IV;ALA, acido α-lipoico.Note: (A) MDA, (B) GSH.I dati sono rappresentati come media ± SD.*P < 0,05, **P < 0,01;***P < 0,001 rispetto al gruppo di controllo.#P < 0,05, ##P < 0,01 rispetto al gruppo DPN.Come mostrato nella Figura 7B, rispetto al gruppo di controllo, il livello di GSH nei gangli della radice dorsale del gruppo DPN è diminuito (p <0,05).I livelli di GSH dei due gruppi di ratti trattati con ALA e AS-IV erano inferiori a quelli del gruppo DPN (p <0,05).Come si può vedere dalle Figure 8A e B, le micrografie di colorazione TUNEL hanno mostrato una maggiore percentuale di cellule positive con frammentazione del DNA nel gruppo DPN (p <0,001), con una percentuale relativamente più bassa di cellule positive con frammentazione del DNA osservata nei due gruppi di ratti trattati con ALA e AS-IV (p <0,05).Come mostrato nelle Figure 8C e D, l'espressione della caspasi-3 scissa nei ratti diabetici era significativamente sovraregolata rispetto al gruppo di controllo (p <0,001).Rispetto al gruppo DPN, l'espressione della caspasi-3 scissa era sottoregolata nei due gruppi di ratti trattati con ALA e AS-IV (p <0,001).Figura 8 Effetto di AS-IV sull'apoptosi.Abbreviazioni: TUNEL, etichettatura terminale del nick-end deossinucleotidilico;SD, deviazione standard;DPN, neuropatia periferica diabetica;AS-IV, astragaloside IV;ALA, acido α-lipoico.Note: (A e B) I risultati della colorazione TUNEL.Barra della scala, 50 µm.(C) Colorazione immunoistochimica della caspasi-3 scissa.Barra della scala, 50 µm.(D) L'espressione della caspasi-3 scissa è stata misurata mediante Western blot.I dati sono rappresentati come media ± DS.*P < 0,05, ***P < 0,001 rispetto al gruppo di controllo.###P < 0,001, #P < 0,05 rispetto al gruppo DPN.Figura 8 Effetto di AS-IV sull'apoptosi.Abbreviazioni: TUNEL, etichettatura terminale del nick-end deossinucleotidilico;SD, deviazione standard;DPN, neuropatia periferica diabetica;AS-IV, astragaloside IV;ALA, acido α-lipoico.Note: (A e B) I risultati della colorazione TUNEL.Barra della scala, 50 µm.(C) Colorazione immunoistochimica della caspasi-3 scissa.Barra della scala, 50 µm.(D) L'espressione della caspasi-3 scissa è stata misurata mediante Western blot.I dati sono rappresentati come media ± DS.*P < 0,05, ***P < 0,001 rispetto al gruppo di controllo.###P < 0,001, #P < 0,05 rispetto al gruppo DPN.L'espressione delle proteine ​​correlate nella via di segnalazione SIRT1/p53 è stata valutata da IHC.L'espressione positiva di SIRT1 è stata osservata principalmente nel nucleo e in parte nel citoplasma.Acetil-p53, Drp1, BAX e BCL-2 sono stati osservati nel citoplasma (Figura 9).Figura 9 Colorazione immunoistochimica di SIRT1, acetil-p53, Drp1, BAX, BCL-2.Barra della scala: 50 µm.Abbreviazioni: DPN, neuropatia periferica diabetica;AS-IV, astragaloside IV;ALA, acido α-lipoico.Figura 9 Colorazione immunoistochimica di SIRT1, acetil-p53, Drp1, BAX, BCL-2.Barra della scala: 50 µm.Abbreviazioni: DPN, neuropatia periferica diabetica;AS-IV, astragaloside IV;ALA, acido α-lipoico.Come mostrato nelle Figure 10A e B, l'analisi Western blot ha mostrato che l'espressione di SIRT1 nei due gruppi di ratti trattati con ALA e AS-IV era significativamente sovraregolata rispetto al gruppo DPN (p <0,05).Come mostrato nelle Figure 10A e C, rispetto al gruppo di controllo, l'espressione di acetil-p53 nei ratti diabetici era significativamente sovraregolata (p <0,001).L'espressione di acetil-p53 nei due gruppi trattati con ALA e AS-IV era significativamente inferiore a quella del gruppo DPN.Come mostrato nelle Figure 10A e D, l'espressione di Drp1 nel gruppo DPN e nel gruppo ALA era superiore a quella nel gruppo di controllo.Rispetto al gruppo DPN, l'espressione di Drp1 è stata sottoregolata nei due gruppi trattati con ALA e AS-IV.L'analisi del rapporto tra BAX e BCL-2 ha mostrato che il rapporto nel gruppo DPN era superiore a quello del gruppo di controllo (p <0,001).Rispetto al gruppo DPN, il rapporto tra BAX e BCL-2 nei due gruppi trattati con ALA e AS-IV è diminuito (Figura 10A ed E).Figura 10 Analisi Western blot di SIRT1, acetil-p53, Drp1, BAX, BCL-2.Abbreviazioni: SD, deviazione standard;DPN, neuropatia periferica diabetica;AS IV, astragaloside IV;ALA, acido α-lipoico.Note: (A) Film di SIRT1, acetil-p53, Drp1, BAX, BCL-2 e bande β-actina.(B–D) Livelli di SIRT1 (B), acetil-p53 (C), Drp1 (D) espressi come valore di densità ottica normalizzato in β-actina.(E) Rapporto tra il valore della densità ottica di BAX e BCL-2.I dati sono rappresentati come media ± DS.*P < 0,05, ***P < 0,001 rispetto al gruppo di controllo.#P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001 rispetto al gruppo DPN.Figura 10 Analisi Western blot di SIRT1, acetil-p53, Drp1, BAX, BCL-2.Abbreviazioni: SD, deviazione standard;DPN, neuropatia periferica diabetica;AS IV, astragaloside IV;ALA, acido α-lipoico.Note: (A) Film di SIRT1, acetil-p53, Drp1, BAX, BCL-2 e bande β-actina.(B–D) Livelli di SIRT1 (B), acetil-p53 (C), Drp1 (D) espressi come valore di densità ottica normalizzato in β-actina.(E) Rapporto tra il valore della densità ottica di BAX e BCL-2.I dati sono rappresentati come media ± DS.*P < 0,05, ***P < 0,001 rispetto al gruppo di controllo.#P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001 rispetto al gruppo DPN.Per esplorare il meccanismo alla base dell'AS-IV che inibisce l'apoptosi cellulare, è stata valutata l'espressione dei geni coinvolti nel percorso SIRT1/p53.L'espressione di SIRT1 nei due gruppi di ratti trattati con ALA e AS-IV era significativamente sovraregolata rispetto al gruppo DPN (p <0,01) (Figura 11A).Rispetto al gruppo di controllo, l'espressione di p53 nel gruppo DPN è stata sovraregolata (p <0,001).Tutti i diritti riservati.